最常見故障為DNA產量過低，主要成因包括菌液培養異常、裂解不充分、洗滌殘留及洗脫效率低。菌液方面，若培養時間不足或轉速過低，菌體濃度不足，需保證37℃、200-220rpm振蕩培養12-16小時，避免過度培養導致菌體老化。裂解步驟中，裂解液與中和液比例失衡或混勻不充分，會影響菌體裂解和核酸釋放，操作時需嚴格按說明書配比，溫和顛倒混勻，避免劇烈震蕩導致基因組DNA污染。洗滌環節若洗滌液未全離心去除，殘留乙醇會抑制后續實驗，需確保最后一次洗滌后充分離心，倒盡廢液并晾干吸附柱。洗脫時，洗脫液體積不足、未預熱或靜置時間不夠，會降低DNA回收率，建議使用50-100μL預熱至65℃的洗脫液，滴加后靜置2-5分鐘再離心。

 

　　其次是DNA純度差，表現為A260/A280比值偏離1.8-2.0范圍，多由蛋白質、RNA污染或試劑殘留導致。蛋白質污染源于裂解不好或中和不充分，可在裂解后增加離心時間，確保上清液澄清無沉淀；若仍有污染，可在洗脫前用蛋白酶K處理。RNA污染則是RNase失活或未添加，需檢查RNase儲存條件，使用前確認其活性，必要時在裂解液中額外添加RNaseA。試劑殘留多為乙醇或鹽離子，可通過增加洗脫前晾干時間、二次洗脫或用TE緩沖液替代水洗脫來解決。

 

　　離心后無上清液或吸附柱堵塞也是高頻問題，主要因菌體過多、裂解液粘稠或離心參數不當。菌液接種量過大易導致裂解后溶液粘稠，建議按試劑盒要求控制接種量（通常1-5mL）。若離心后無上清，可適當提高離心轉速和時間，若吸附柱堵塞，可將上清液過柱前再次離心，去除雜質后再上樣。

 

　　此外，洗脫后無DNA可能是吸附柱失效或洗脫液pH不適宜。吸附柱需密封冷藏保存，避免受潮失效；洗脫液pH應維持在7.0-8.5，若pH過低會影響DNA與洗脫液結合，可調整緩沖液pH值后重新洗脫。